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白酒和黄酒中生物胺的高效液相色谱分析法(一)

2025-08-28 13:12:41 来源:怒猊渴骥网   

十九大时光|高速路腾架深山 靠“夫妻桩”寸寸深挖

黄酒属于酿造酒,白酒酒度一般为15°左右,和黄在世界三大酿造酒(黄酒、酒中葡萄酒和啤酒)中占有重要的生物色谱一席。它是高效以稻米、黍米、液相黑米、分析法玉米、白酒小麦等为原料,和黄经过蒸料,酒中拌以麦曲、生物色谱米曲或酒药,高效进行糖化和发酵酿制而成。液相黄酒含有丰富的分析法营养,有“液体蛋糕”之称,白酒它含有众多生物活性成分,如酚类物质和谷胱甘肽等,能够对人体起到清除自由基,延缓衰老,抑制肿瘤等的生理作用。白酒是中国的国酒,有着2000多年的历史,是一种酒精含量在38%~65%之间的澄清、透明的发酵酒精饮料,通常由高粱或玉米、大米、小麦、豌豆、小米和高粱混合制成。白酒是一种著名的蒸馏酒,其生产工艺不同于其它蒸馏酒,它结合了两种独特的发酵和蒸馏过程,即在发酵过程中,淀粉转化为糖与糖转化为酒精两个过程是同时进行的。白酒中含有丰富的风味成分,包括有机酸、酯、内酯、酚类、杂环、萜类和芳香族化合物。此外,白酒还含有氨基酸和多肽等对人体有益的潜在功能成分。

等对人体有益的潜在功能成分。酒中富含氨基酸,而氨基酸是生物胺的前体物。发酵过程复杂且难以控制,易产生潜在有害物质—生物胺。生物胺(Biogenicamine,BA)是在酒和发酵食品中经常检测到的一类具有生物活性、低分子质量的含氮化合物,对人体有不利影响。氨基酸含量被认为是葡萄酒酿造过程中生物胺形成的主要原因。食品中常见的生物胺主要有:组胺、色胺等杂环胺,酪胺、苯乙胺等芳香族胺,腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等脂肪族胺。其中,组胺和酪胺是食品中对人体影响最大的两种生物胺,分别由组氨酸和酪氨酸脱羧形成。适度摄入生物胺对人体健康起到促进作用,而摄入过量生物胺在人体蓄积会引起许多不适症状,如头疼、呕吐等。过量摄入酪胺还会引起边缘血管收缩,导致机体心律变快、呼吸增强,同时降低体内去甲肾上腺素水平含量。超过100mg会引起偏头痛,超过1080mg会引起严重中毒。组胺的过量摄入会增加肾上腺素和去甲肾上腺素的释放,并刺激运动神经和感觉神经,引起过敏和高血压。组胺是葡萄酒中常见的一种生物胺,不同国家对其限定标准各不相同,其中以德国标准最为严格,规定不得高于2mg/L。欧盟规定食品中组胺含量不得超过100mg/kg,酪胺含量不得超过100~800mg/kg。目前,酒中生物胺含量的检测方法有多种,如毛细管电泳法(Capillaryelectrophoresis,CE)、高效液相色谱法(Highperformanceliquidchromatography,HPLC)、生物传感器法(Biosensormethod)、薄层色谱法(Thinlayerchromatography,TLC)等。其中HPLC法实际应用最为广泛。HPLC仪能够同时分析多个目标物,分析速度快且准确性高,因而在生物胺的检测中应用最多。由于生物胺没有共轭特征结构,在紫外检测器上响应较弱,所以对其进行柱前衍生,使其产生紫外和荧光吸收。常用的衍生试剂主要有邻苯二醛(OPA)、丹磺酰氯(Dns-C1)、二硝基苯甲酰氯(DABS-C1)、苯甲酰氯(Benzoylchloride)。丹磺酰氯是最为常用的衍生试剂,其衍生物相对稳定,在避光条件下可稳定存放12~14h。试验中通过丹磺酰氯柱前衍生-HPLC法对黄酒与白酒中生物胺进行检测与比较。

一、材料与方法

1、材料与试剂

山西代县黄酒与内蒙草原王白酒系列均来自于当地企业;9种生物胺标准品(纯度均>98%):色胺(CAS号:61-54-1)、β-苯乙胺(CAS号:64-04-0)、腐胺(CAS号:110-60-1)、尸胺(CAS号:462-94-2)、盐酸吡哆胺(CAS号:524-36-7)、组胺(CAS号:51-45-6)、酪胺(CAS号:51-67-2)、亚精胺(CAS号:124-20-9)、精胺(CAS号:71-44-3),上海源叶生物科技有限公司;丹磺酰氯(CAS号:605-65-2),上海麦克林生化科技有限公司;饱和碳酸氢钠、氯化钠、甲酸、正丁醇,西陇化工股份有限公司;乙酸铵,北京迈瑞达科技有限公司;乙腈(色谱纯),赛默飞世尔科技有限公司;丙酮(分析纯)、三氯甲烷(分析纯),北京化工厂;乙醚(分析纯),国药集团化学试剂有限公司。

2、仪器、设备

LC-20ATHPLC仪,日本岛津公司;MX-F涡旋振荡器,大龙兴创实验仪器有限公司;UGC24M氮吹仪,北京优晟联合科技有限公司;VELOCITY18R大容量冷冻离心机,澳大利亚Dy-namica公司;实验室pH计,奥豪斯仪器(上海)有限公司;恒温水浴锅,山东甄城华鲁电热仪器有限公司;WaterPro超纯水系统,美国Labconco公司;ME104/02电子分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;0.22μm滤膜针头滤器,天津市津腾实验设备有限公司。

3、方法

(1)标准溶液的配制

准确称取标准品,以0.1mol/L稀盐酸为溶剂,配制质量浓度为1000mg/L的生物胺单体标准储备溶液。准确量取不同体积的储备液,稀释,配制成终质量浓度分别为50.00,25.00,5.00,1.00,0.50,0.25,0.20,0.10,0.05mg/L的梯度标准溶液。以上所配溶液于4℃冰箱避光存放,保存期为2周。

(2)样品的萃取与衍生

量取酒样10.00mL,向其中加入适量氯化钠至饱和。准确量取上层试样5.00mL,置于15mL离心管中,逐滴加入4~7滴5mol/L氢氧化钠溶液,将溶液pH值调至11.5~12.0范围。加入正丁醇-三氯甲烷(体积比1∶1)混合溶液5.0mL,充分均匀混合后4000r/min离心10min。吸取并保留上层有机相,重复操作两次,合并提取液。取3.0mL提取液,加入0.2mL1mol/L盐酸,充分混合后吸取2mL溶液,在40℃条件下氮气吹干,然后加入1.0mL0.1mol/L盐酸,充分溶解提取物,待衍生。将上述提取液(1mL)置于15mL塑料离心管中,依次加入1mL饱和碳酸氢钠溶液、100μL氢氧化钠溶液(1mol/L)、1mL丹磺酰氯衍生试剂(10mg/mL丙酮为溶剂),涡旋振荡60s后置于60℃水浴环境中衍生,15min后取出,加入100μL谷氨酸钠溶液(50mg/mL饱和碳酸氢钠为溶剂)终止衍生。将上述混合物振荡混匀后,在60℃条件下继续反应15min,取出冷却至室温,向其中加入1mL超纯水,旋涡振荡1min后混匀,置于40℃低温水浴环境下氮吹除去有机溶剂(约1mL),加入0.5g氯化钠,待溶解后继续加入5mL有机溶剂乙醚,振荡2min后静置分层。将上层有机层转移至15mL玻璃试管中,水相(下层)再次萃取。将两次萃取液合并后氮气吹干,加入复溶液乙腈1mL,完全溶解后经0.22μm针头滤器过滤,冷藏待测。

(3)色谱条件

采用赛默飞HGOLDC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)分离,紫外检测波长254nm,进样体积20μL,柱温35℃,流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液(含0.1%乙酸)-乙腈(9∶1,V/V),流动相B为乙腈-0.01mol/L乙酸铵溶液(9∶1,V/V),流速0.8mL/min。见表1梯度洗脱程序1。

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相关链接:乙酸铵丹磺酰氯盐酸吡哆胺二硝基苯甲酰氯

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